VetBact

Inledning

Gramfärgning är en s.k. differentialfärgningsteknik eftersom man kan skilja på två stora grupper av bakterier genom denna metod. Dessa två grupper är grampositiva och gramnegativa bakterier, som färgas mörklila respektive skära till röda.

Princip

Grampositiva bakterier har en tjock cellvägg (peptidoglykan), som består av flera lager och kan liknas vid ett nätverk. Gramnegativa bakterier har en mycket tunnare cellvägg och dessutom ett yttermembran. Kristalviolett (KV⁺), som är det primära färgämnet, binder till negativt laddade grupper på bakterien och färgar den lila. Man använder sedan jod (I^-), som bildar ett stort komplex (KV-I) med KV och därmed binds färgen till bakterien. När grampositiva bakterier behandlas med avfärgningsvätskan (etanol-aceton), så dehydreras bakterien och färgen stannar kvar. När gramnegativa bakterier behandlas med avfärgningsvätskan, så löses yttermembranet upp och peptidoglykanen exponeras, så att även KV-I-komplexet tvättas ut. Därefter gör man en motfärgning med safranin eller basiskt fuksin, som gör att gramnegativa bakterier blir skära eller röda.

Metod

1. Dela in objektglaset (vid behov), med hjälp av diamantpenna.
2. Slamma lite kolonimaterial i en droppe NaCl, lufttorka (ev. i inkubator).
3. Fixera preparatet genom att föra objektglaset, med preparatsidan upp, 6-8 ggr genom brännarens låga.
4. Tillsätt kristallviolett, vänta 1 minut.
5. Häll av färgen och skölj försiktigt med Lugols lösning.
6. Tillsätt Lugols lösning (som innehåller jod), vänta 1 minut.
7. Häll av Lugols lösning och droppa försiktigt på aceton-etanollösning.
8. Skölj försiktigt med vatten.
9. Tillsätt saffranin, vänta 20 sekunder.
10. Avsköljning med vatten.
11. Sug försiktigt av överskottet av vätska från preparatet med hushållspapper och låt lufttorka tills preparatet är helt torrt.

Grampositiva bakterier

Medlemmar av fyla Bacillota och Actinomycetota (undantag: genus Mycobacterium).

Gramnegativa bakterier

Medlemmar av fyla Bacteroidota, Campylobacterota, Cyanobacteria, Fusobacteriota, Pseudomonadota (undantag: vissa medlemmar av ordningen: Rickettsiales), Spirochaetota och Thermodesulfobacteriota.

Uppdaterad: 2023-09-28.