Blandad syra-fermentering

Allmänt

En del bakterier kan fermentera (jäsa) glukos till en blandning av följande organiska syror: myrsyra, ättiksyra och mjölksyra. Detta kallas blandad syra-jäsning och orsakar kraftigt sänkt pH i mediet. Därför kan blandad syrajäsning påvisas genom tillsats av indikatorn metylrött (MR). Testet kallas ibland för MR-test.

Metodik

1. Slamma upp en bakteriekoloni från en renkultur i MR/VP-medium.
2. Inkubera vid 30°C under 3 dygn eller 37°C under 48 tim.
3. Tillsätt 2-3 droppar av en metylrött-lösning.

• Positivt testresultat: rött färgomslag
• Negativt testresultat: inget färgomslag.

Användning

Vissa medlemmar av familjen Enterobacteriaceae har blandad syrajäsning (se resp. bakteriesida), som alltså kan användas för att skilja på dessa bakterier.

Uppdaterad: 2017-12-08.

Citrattest

Allmänt

En del bakterier kan utnyttja citrat som enda kolkälla och citrattestet visar om bakterien ifråga kan göra det.

Metodik

1. Inokulera ett citrat-buljongrör med en liten mängd bakterier.  Man kan också stryka ut eller stickinokulera på "Simmons citratrör".
2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.

• Positivt testresultat: växt i citrat-buljong eller växt med blått färgomslag i Simmons citratrör.
• Negativt testresultat: ingen växt i citrat-buljong eller växt men utan färgomslag (d.v.s. fortfarande grön färg) i Simmons citratrör.

Användning

Citrat-testet används bl.a. för att skilja Citrobacter freundii från Escherichia coli.

Uppdaterad: 2018-06-06.

Divätesulfid-produktion

Allmänt

Metodik

1. Stickinokulera H₂S-mediet med bakterier från en koloni.
2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.
   

• Positivt testresultat: svärtning av mediet.
• Negativt testresultat: oförändrat medium.
  

Användning

Kan bl.a. användas för differentiering av vissa Campylobacter-arter.

Uppdaterad: 2012-12-11.

DNastest

Allmänt

Många bakterier har enzymer, som bryter ner nukleinsyra för att bakterien ska kunna använda de ingående nukleotiderna till att bygga upp den egna nukleinsyran. DNas är ett sådant enzym som alltså bryter ner DNA. Förekomst av DNas är karakteristiskt för vissa arter eller stammar av bakterier och används alltså för typning.

Metodik

Man kan testa om bakterien har DNas genom att odla dem på en agarplatta, som innehåller DNA. Om bakterien har DNas och om man låter bakterierna växa över natten så kommer DNA att brytas ner och om man då häller utspädd saltsyra (HCl) på plattan, så får man en klar zon närmast kolonierna eller stryket och en utfällning på resten av plattan. Detta beror på att de enskilda nukleotiderna är lösliga i utspädd HCl, medan DNA faller ut.

Användning

Testet är användbart för att skilja:
 

• Serratia spp. från Enterobacter spp.
• Staphylococcus aureus (de flesta stammar är koagulaspositiva) från koagulasnegativa Staphylococcus spp.
• Moraxella catarrhalis från Neisseria spp.

Uppdaterad: 2017-12-08.

Hippurattest

Allmänt

Vissa bakterier kan hydrolysera hippurat till aminosyran glycin och benzoat med hjälp av enzymet hippurikas. Glycin kan påvisas med hjälp av ninhydrin, som reagerar med fria aminogrupper (-NH₂) och det bildas en blåfärgad produkt.

Metodik

1. Slamma upp en plast- eller platinaögla med bakterier (t.ex. Campylobacter sp.) i 0,5 ml natriumhippuratlösning.
2. Inkubera suspensionen vid 37ºC under 2 tim i vattenbad.
3. Tillsätt därefter försiktigt 0,2 ml ninhydrinlösning utan omblandning.
4. Inkubera röret under ytterligare 10 min vid 37ºC före avläsning.

• Positivt testresultat: Djupt mörkblå färg.
• Negativt testresultat: Blekblå färg.

Användning

Hippurat-testet används framför allt för att skilja Campylobacter jejuni  (hip+) från Campylobacter coli (hip-) och för att skilja på olika streptokocker (se figur). Används också i kombination med andra tester för att typa Brachyspira spp.

Uppdaterad: 2017-03-31.

Indol-test

Uppdaterad: 2017-12-20.

Kaliumhydroxidtest

Allmänt

Syftet med kaliumhydroxidtestet (KOH testet) är att identifiera gramnegativa bakterier. KOH löser upp det tunna peptidoglykanlagret i cellväggen hos gramnegativa bakterier, men påverkar inte cellväggen hos grampositiva bakterier. Lyseringen av cellväggen hos gramnegativa bakterier innebär att innehållet inklusive DNA frigörs. Frisläppt DNA gör lösningen viskös, fastnar på plastöglan och blir tråddragande. Cellväggen hos grampositiva bakterier påverkas inte av KOH, då de har ett tjockare peptidoglykanlager. Detta medför att cellen inte lyserar och inget DNA frigörs och lösningen blir inte viskös.

Material

• Objektglas
• Plastögla
• 3% KOH

Metod

• Applicera en droppe 3% KOH på objektglaset
• Överför en välfylld ögla med bakteriematerial (odlade 24-48 tim) till objektglaset med KOH
• Blanda väl
• Gramnegativa bakterier blir viskösa och tråddragande inom 30 sek
• Använd positiva och negativa kontroller

Positivt resultat: Lösningen med bakterier (gramnegativa) blir viskös

Negativt resultat: Lösningen med bakterier (grampositiva) blir inte viskös

Användning

Syftet med KOH testet är att snabbt skilja mellan gramnegativa och grampositiva bakterier som ett komplement till Gramfärgning. Testet är inte användbart för anaeroba bakterier.

Uppdaterad: 2017-12-20.

Katalas-test

Allmän information

Många aeroba bakterier och de flesta som är fakultativt anaeroba producerar enzymet katalas, som ingår i bakteriernas enzymsystem för avgiftning av H₂O₂ (väteperoxid). H₂O₂ bildas från superoxidradikalen med hjälp av enzymet superoxiddismutas. Många syretoleranta bakterier har peroxidas (som inte är samma enzym som cytokrom c oxidas) i stället för katalas. Obligata anaerober saknar både superoxiddismutas och katalas.

Katalas innehåller en hemgrupp vid den aktiva ytan och följande reaktion katalyseras med ett mycket högt omsättningstal (turnover number):

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

Metodik

1. Sprid bakterier på en agarplatta och inkubera den över natten (18-24 tim) vid lämpliga betingelser.
2. Applicera en droppe 3% H₂O₂ på ett objektglas. Var försiktig med H₂O₂ som är frätande !!!Samla upp bakterier från en koloni, med en plast- eller platinaögla och applicera dem på ett objektglas.
3. Om bakterierna tas från en blodplatta måste man undvika att få med agar, eftersom hemoglobinet också innehåller hemgrupper, som kan ge upphov till en falskt positv reaktion.

• Positivt testresultat: Gasbildning (O₂) i form av bubblor visar att bakterien har katalas.
• Negativt testresultat: Ingen gasbildning.

Användning

Katalastestet används huvudsakligen för grampositiva bakterier och kan t.ex. utnyttjas för att skilja Staphylococcus spp. och Micrococcus spp., som är katalaspositiva från Streptococcus spp. respektive Enterococcus spp. som är katalasnegativa.

Uppdaterad: 2017-12-20.

Koagulas-test

Allmänt

Metodik

1. Slamma upp en bakteriekoloni från den misstänkta renkulturen i 0,5 ml plasma från häst, kanin eller människa.
2. Inkubera vid 37ºC.
3. Avläs efter 4 timmar. Vid negativ reaktion (se nedan) fortsätt inkuberingen.
4. Slutavläs efter totalt ett dygn.
   

• Positiv reaktion om plasman koagulerar och koaglet är stabilt, d.v.s. löses inte upp igen efter omskakning.
• Negativ reaktion om plasman inte koagulerar eller koaglet löses upp efter omskakning.

Användning

Används för att skilja Staphylococcus aureus från koagulasnegativa Staphylococcus spp. Observera dock att vissa stammar av S. aureus kan vara koagulasnegativa, men det är ovanligt. Vissa stammar av S. hyicus och S. intermedius kan vara koagulaspositva. S. pseudintermedius är koagulaspositiv, men först efter 24 tim.

Uppdaterad: 2013-10-01.

Lecithinastest

Allmänt

Många bakterier har enzymer som kan bryta ner lipider, s.k. lipaser. Lecithinas, som även kallas fosfolipas C, är ett sådant enzym som spjälkar fosfolipiden lecithin (= t.ex. fosfatidylkolin). Fosfolipider, som är laddade är vanligen lösliga i vatten, men en av produkterna som bildas vid spjälkningen, nämligen en diglycerid,  är oladdad och har två långa kolvätekedjor. Den är därför olöslig i vatten och detta utnyttjas i lecithinas-testet då man odlar bakterierna på äggule-agar. Äggula innehåller mycket lecithin.

Metodik

1. Stryk ut bakterierna i form av ett streck på äggule-agar.
2. Läs av plattan efter 24 tim.

• Positivt testresultat: Utfällning runt utstryket av bakterier.
• Negativt testresultat: Ingen utfällning.

Figure: Bacillus cereus på äggule-agar. Notera utfällningen runt bakteriestryket, som visar att den är positiv för lecithinas.

Användning

Kan bl.a. användas för att skilja på vissa arter inom genus Bacillus.

Uppdaterad: 2017-11-30.

Oxidas-test

Allmän information

Bakterier, som har aerob cellandning, har ofta cytokrom c och ett cytokrom c oxidas, vilket i kombination med andra metoder kan användas vid typning. Man använder ofta ett kommersiellt test, vilket innehåller en artificiell elektronacceptor (N, N, N', N'-tetrametyl-p-fenylendiamin, se Fig. 1), som ändrar färg beroende på redoxtillstånd. Substansen är en s.k. redoxindikator och den kan alltså oxideras av den oxiderade formen av cytokrom c. Cytokrom c oxidas är det sista enzymet i andningskedjan, där det normalt reducerar syre till vatten och pumpar ut protoner enligt följande nettoreaktion:

4 Fe²⁺-cytochrome c_red + 8H⁺_in + O₂ → 4 Fe³⁺-cytochrome c_ox + 2H₂O + 4H⁺_out
 
Cytokrom c oxidas är ett transmembranproteinkomplex (Komplex IV), som också finns i mitokondriernas plasma- (inner-) membran.

Metodik

1. Håll plastampullen (som innehåller en glasampull) rättvänd med tippen vänd ifrån dig och krossa glasampullen, som ligger inuti plastampullen, mellan tummen och pekfingret.
2. Applicera ett par droppar av oxidasreagenset på ett filtrerpapper.
3. Överför bakterier från en koloni med hjälp av en plast- eller platinaögla till fläcken med reagenset på filtrerpappret. Kolonikulturen ska ha inkuberats vid lämplig temperatur under 18-24 tim.

• Positivt testresultat: Mörkt blålila färgomslag inom 10-30 sek.
• Negativt testresultat: Inget färgomslag eller färgomslag efter mer än 30 sek.

Notera att oxidasreagenset inte är stabilt efter det att ampullen har öppnats. Det kan användas under någon timmes tid, men det oxideras så småningom av syret i luften.

Användning

Oxidas-testet används ofta för identifiering av gram-negativa bakterier. T.ex. för att identifiera medlemmar av familjen Enterobacteriaceae, som är oxidas-negativa, utom genus Plesiomonas (ox+). Medlemmar av familjen Pseudomonadaceae, samt genus Aeromonas och Campylobacter är oxidas-positiva.

Uppdaterad: 2017-12-20.

Ureastest

Allmänt

Vissa bakterier har enzymet ureas, som i närvaro av H₂O bryter ner urea (=urinämne eller karbamid) till NH₃ (ammoniak) och CO₂ (kol­di­oxid), som bildar ammonium­karbonat i närvaro av vatten. Se kemisk reaktionsformel.

Metodik

Man kan testa om bakterien har ureas genom att odla dem i ureas-medium, som innehåller en pH-indikator. Om bakterien har ureas bildas ammoniumkarbonat och odlingsmediet blir basisk d.v.s. färgen slår om till röd (cerise) färg.

Ureas-buljong:

Användning

Ureastestet kan bl.a. användas för att skilja E. coli, som är ureasnegativ, från Proteus spp., som är ureaspositiv.

Uppdaterad: 2017-03-31.

Voges-Proskauer- (VP-) test

Allmänt

2 pyruvate + NADH --> 2CO₂ + 2,3-butanediol.

Metodik

1. Slamma upp en bakteriekoloni från den renkultur, som ska undersökas, i VP/MR-buljong.
   
2. Inkubera vid 30-37ºC under 24-48 tim.
3. Tillsätt 0,2 ml 40% KOH och därefter 0,6 ml alfa-naftollösning.
   

• Positivt testresultat: rosa färgomslag.
• Negativt testresultat: inget färgomslag.
  

Användning

Klebsiella spp. och Enterobacter spp. har butandiolfermentation till skillnad från Escherichia coli, Salmonella spp. och Shigella spp.

Uppdaterad: 2012-12-11.